Real-time PCR

[sevda_sj]

تکثیر microRNA به کمک Real-time PCR یکی از پر کاربردترین تکنیک ها در حوزه تحقیقاتی microRNA می باشد. اساس این تکنیک مشابه روشهای معمولی Real-time PCR می باشد، با این تفاوت که به واسطه کوچکی اندازه microRNAها راهکارهای خاصی برای این منظور ارایه شده است. افزودن یک دم polyA به miRNAهای مورد نظر یکی از این شیوه هاست که درکیت PARSGENOME MiR-Amp kit نیز از همین روش برای تکثیر miRNAها استفاده شده است. Real-time PCR
مشخصات کیت
نکته:
در این پروتکل مراحل افزودن مواد مصرفی و انجام واکنش ها به کمک سیستمی از شماره بندی ها و برچسب های رنگی (به همان ترتیب که بر روی میکروتیوب های کیت آمده است) نشان داده شده است.
روش تکثیر miR با استفاده از کیت PARSGENOME MiR-Amp شامل یک پروتکل سه مرحله ای به شرح زیر می باشد:
۱) مرحله افزودن آنزیم PolyA Polymerase
2) سنتز رشته اول cDNA
3) تکثیر به روش Real-time PCR
———–

1) مرحله افزودن آنزیم PolyA Polymerase
نکته:
استخراج RNA می بایستی به روشی صورت پذیرد که RNAهای با سایز کوچک را بتواند حفظ کند (برای اطلاعات بیشتر به پروتکل استخراج miRNA موجود در سایت پارس ژنوم مراجعه کنید).
توصیه می شود که از میکروتیوبها و سرسمپلرهای RNase free استفاده شود.
حمل و نقل مواد مصرفی و انجام واکنشها همواره بر روی یخ ( دمای ۴ºC) انجام شود.
روش اجرا:

تمامی مواد فوق با کمک پیپت کردن به آرامی با یکدیگر مخلوط شده و در نهایت اسپین شود.
واکنش فوق در دمای Cº۳۷ و به مدت ۱۰ دقیقه انکوبه شود.
نکته:
- در صورت لزوم محصول واکنش فوق را می توان در فریزر Cº۸۰- و حداکثر تا ۶ ماه نگهداری کرد.
- محصول نهایی را می توان تا چند مرحله رقیق سازی نمود. در مورد ژن های با بیان بالا این عمل توصیه می شود.

2) سنتز رشته اول cDNA
روش اجرا:

نکته:
- محصول فوق قابل نگهداری در فریزر ºC20- به مدت حداکثر ۲ ماه می باشد.
- محصول نهایی را میتوان تا چند مرحله با آب دپک رقیق سازی نمود. در مورد سلولها و یا بافتهای با بیان بالای microRNA این عمل توصیه می شود.
- توصیه می شود عمل رقیق سازی درست قبل ازمرحله real-time PCR انجام شده و cDNA به میزان مورد نیاز با آب دپک رقیق شود.

3) تکثیر به روش Real-time PCR
نکته:
- ویالهای مربوط به SYBER Green master mixرا بدور از نور نگهداری نموده و بلافاصله قبل از استفاده با سر و ته کردن ویال, محتویات تیوب را مخلوط کنید. سایر مواد به کمک ورتکس و اسپین سریع، آماده مصرف می گردند.
- توجه داشته باشید که SYBR Green master mix فاقد رنگ ROXمی باشد. میزان ROX مصرفی با توجه به نوع دستگاه PCR متفاوت است.
- به دلیل امکان حضور مهار کننده های واکنش PCR،حداکثر میزان مجاز استفاده از cDNA درPCR ، ۱۰% از حجم غیر رقیق شده اولیه می باشد.

مراحل انجامPCR دما و مدت زمان

۱ سیکل واسرشتی ۹۵درجه سانتیگراد، ۵دقیقه
۹۵درجه سانتیگراد، ۵ثانیه
۴۰ سیکل تکثیر ۶۰-۶۲درجه سانتیگراد، ۲۰ثانیه
۷۲درجه سانتیگراد، ۳۰ثانیه

[k.ahmadi]

سلام دوست عزیز ممنون از تاپیک خوبتون
من دارم سمیناری برای PCR آماده میکنم این مطلب خیلی ب دردم خورد البته موضوع من روشهای ایجاد جهش با PCR هستش اگه اطلاعاتی در موردش دارین ممنون میشم بذارین تا استفاده کنیم.

[sevda_sj]

سلام دوست عزیز ممنون از تاپیک خوبتون
من دارم سمیناری برای PCR آماده میکنم این مطلب خیلی ب دردم خورد البته موضوع من روشهای ایجاد جهش با PCR هستش اگه اطلاعاتی در موردش دارین ممنون میشم بذارین تا استفاده کنیم.

سلام دوست گرامی
خوشحالم که تونستم کمکی کرده باشم
چشم اگر مطلبی بود حتما در اختیارتون میزارم

تشکر از بازدیدتون