تکنیک های سلولی و مولکولی مورد استفاده در مراکز تحقیقاتی

[هیوا]

با سلام به تمام دوستان و علاقه مندان به تحقیقات در زمینه سلولی و مولکولی.
دوستان در این تاپیک قراره که تکنیک های سلولی و مولکولی که به صورت روتین در آزمایشگاه های تحقیقاتی استفاده میشه به ترتیب معرفی و توضیح داده بشه.علاوه بر این هریک از دوستان اگر برای انجام تحقیقاتش به تکنیک خاصی نیاز داره یا اینکه در مورد تکنیک خاصی سوال داره میتونه همینجا مطرح کنه.انشا الله پاسخ داده خواهد شد.

[هیوا]

تاريخچه RFLP ‌
RFLP‌‌‌‌ اولين‌ بار در سال‌ 1974 به‌ عنوان‌ يك‌ ماركر ژنتيكي‌ توسطGrodzicker ‌ و همكارانبراي‌ تعيين‌ جهش‌ در ويروس‌ به‌ كار گرفته‌ شد. استفاده‌ ازRFLPبه‌ عنوان‌ ماركربيماري‌ ژنتيكي‌اولين‌ بار توسطKon ‌و Dozy (1974) براي‌ آناليز بيماري‌ كم‌ خوني‌داسي‌ شكل‌ به‌ كار گرفته‌ شد.Botstein و همكاران‌ 1980تئوري‌ پايه‌ اين‌ روش‌ رابراي‌ نقشه‌يابي‌ ژنهاي‌ مرتبط‌ با بيماري‌ درانسان‌ مطرح‌ كردند. Southern روش‌انتقال‌ الگويDNA ‌ و پروب‌ (كاوشگر) از ژل‌ به‌غشاء نيتروسلولزي‌ درRFLPرا ابداع‌كرد.
Backman‌‌‌‌ (1986) براي‌ اولين‌ بار استفاده‌ از اين‌ نشانگر را مطرح‌نمود. كاربردهاي‌ مهم همچون‌ نقشه‌يابي‌ و دستكاري‌ مكانهاي‌ ژنهاي‌ كنترل‌ كننده‌صفات‌ كمي‌ با استفاده‌ ازRFLPدر سال‌1983 توسطBackman‌ وSoller بيان‌ گرديد. باگسترش‌ كاربرد اين‌ نشانگر قدرتمند چند ژن‌ يا ژنوم‌آناليز شدند تعدادي‌ ازگونه‌هاي‌ دام‌ چون‌ گاو، گوسفند، بز، اسب، خوك‌ و جوجه‌ نيز با استفاده‌ ازاين‌نشانگر آناليز شدند

كليات‌ تكنيك‌
‌‌‌‌مشخص‌ شده‌ است‌ كه‌ ژنوم‌موجودات‌ به‌ طور طبيعي‌ داراي‌ تفاوتهائي‌ در رديف‌ بازهاي‌ خطي مي‌باشند اين‌تغييرات‌ طبيعي‌ كه‌ سبب‌ گوناگوني‌ در افراد يك‌ جمعيت‌ مي‌شود چند شكلي‌ژنتيكي‌نام‌ دارد. اگر اين‌ چند شكلي‌ در رديف‌ بازهايDNA ‌ در جايگاه‌ شناسائي‌آنزيم‌ محدودكننده‌ ايجادشده‌ باشند به‌ راحتي‌ قابل‌ رديابي‌ استRFLP . وجودالگوهاي‌ غيريكسان‌ است‌ كه‌ بر اثر هضم‌آنزيمي‌ يك‌ ناحيهِ خاص‌ ازDNA بوسيلهِآنزيمهاي‌ محدود كننده‌ مشخص‌ مي‌شود. اين‌ الگوهاي‌غيريكسان‌ به‌ علت‌ تفاوتDNA ‌ بسته‌ به‌ حضور يا عدم‌ حضور جايگاه‌ آنزيمهاي‌ محدود كننده‌بوجود مي‌آيد اين‌الگوها را به‌ دو شكل‌ مي‌توان‌ مشخص‌ كرد .
- هضم‌ آنزيمي‌ و سپس‌ الكتروفوز واستفاده‌ از لكه‌گذاري‌ ساترن
PCR فطعه‌ مورد نظر و هضم‌ آنزيميRFLP‌‌‌‌ مستقيما روي‌ تظاهر ژن‌ از طريق‌ تغيير در شكل‌گيريmRNA ‌و ميزان‌ و تعدادنسخه‌برداري‌ تاثير مي‌گذارد.

www.iranbiology.ir

[mrezakarimi]

از مطلب خوبی که شروع کردید ممنونم انشاالله ادامه داشته باشه
منم سعی می کنم در آینده ای نزدیک فعالیتم رو شروع کنم با عرض پوزش یکم سرم شلوغه

[هیوا]

از حضورتون در سایت و علی الخصوص در بخش زیست شناسی بسیار خوشحالم.خوش آمدید. منتظر فعالیت های بیشتر شما در سایت و علی الخصوص بخش زیست شناسی هستیم

[هیوا]

PCR یا polymerase chain reaction :


تعريف PCR
به طور كلي Polymerase Chain Reaction (PCR) به روش ازدياد مقادير جزيي DNA يا RNA (ازدياد RNA با روش RT-PCR امكان پذير است) تا حد مشاهدهء آنها توسط روش هاي ساده و رايج آزمايشگاهي اطلاق مي شود. قابليت PCR در ازدياد اسيدهاي نوكلئيك موجود در نمونه مورد آزمايش موجب شناسايي سريع و اختصاصي نوع سلول يا ميكروارگانيسم مورد نظر در نمونه مذكور مي گردد كه اين ويژگي علاوه بر بكارگيري PCR در تشخيص آزمايشگاهي بيماريها شناسايي انواع سلولها، آنرا به عنوان ابزاري مطمئن و حساس در زمينه پژوهش هاي علمي مطرح مي سازد.
از زمان معرفي PCR در سال 1985، بكارگيري آن در تحقيقات بيولوژيكي پايه و كاربردي موجب ايجاد تغييرات اساسي گرديده است. PCR يكي از جديدترين تكنولوژي هاي آزمايشگاهي است كه در تشخيص بيماريهاي عفوني، پزشكي قانوني و ناهنجاريهاي ژنتيكي مورد استفاده و توجه قرار گرفته است. در خصوص كارآيي اين روش در تشخيص به عنوان مثال مي توان تقليل مدت زمان تشخيص آزمايشگاهي اختصاصي باسيل سل در نمونه هاي كلينيكي را از 7-6 هفته به 7-6 ساعت حتي با وجود تعداد اندك باسيل در نمونهء آزمايشگاهي ذكر كرد. از نكات جالب توجه ديگر اينكه با استفاده از تكنيك حساس PCR ، DNA ميكروارگانيسم هايي نظير باسيل جذام و باسيل سل از نمونه هاي باستاني با قدمت بيش از 1000 سال شناسايي و جدا گرديده است كه نتايج حاصله گامي مهم در راه شناخت و مطالعه بيش از پيش تاريخچه علم پزشكي بوده ضمن آنكه اين موفقيت توانسته است راهگشاي ايجاد شاخه هاي ديگري از علوم نظير پالئوباكتريولوژي باشد.

هر چرخه PCR شامل سه مرحله مي باشد(شکل 1):
1-مرحله تقليب يا تغيير ماهيت
(Denaturation Step) :
در اين مرحله مولكولهاي دو رشته اي DNA بوسيله حرارت بالا (حدود 94 درجه سانتيگراد) از همديگر جدا گرديده و به مولكولهاي تك رشته اي تبديل مي شوند.
2-مرحله پيوند زني
(Annealing or Hybridization Step) :
در اين مرحله كاهش دماي واكنش صورت مي گيرد تا اينكه پرايمرها بتوانند به مولكولهاي DNA تك رشته اي پيوند زده شوند. درجه حرارت مورد استفاده براي اين مرحله مي تواند از 30 درجه سانتيگراد تا 72 درجه سانتيگراد متغير باشد.
3-مرحله توسعه (Extension Step) :
در اين مرحله آنزيم Taq پليمراز (DNA پليمراز) پرايمرها را در روي DNA تك رشته اي امتداد مي دهد تا DNA دو رشته اي جديد بسازد. درجه حرارت لازم براي اين مرحله 72 درجه سانتيگراد مي باشد.



شکل 1



از زمان اختراع PCR، دو پيشرفت تكنيكي عمده به طور قابل توجهي روند PCR را اصلاح كرده است. اولين پيشرفت، بكارگيري و ترويج پليمرازهاي مقاوم به حرارت همانند Taq پليمراز بوده است كه اين آنزيم توانايي مقاومت در برابر مرحله تغيير ماهيت يا تقليب يعني حدود 94 درجه سانتيگراد را دارد. اين بدان معني است كه در حال حاضر مي توان بدون افزودن آنزيم پليمراز تازه بعد از هر مرحله تغيير ماهيت (تقليب) به لوله هاي PCR، آزمايش PCR را انجام داد. دومين پيشرفت عمده، توسعهء تجارتي بلوك هاي حرارتي قابل برنامه ريزي مي باشد كه اين بلوك ها به ترمال سايكلرها (Thermal cycler) معروف هستند. استفاده از ترمال سايكلر در انجام PCR باعث حذف مرحلهء خسته كننده و وقت گير انتقال لوله‌هاي PCR از يك بن ماري به بن ماري ديگر مي شود ، زيرا اين دستگاه كه قبلاً بوسيله خود آزمايش كننده تنظيم و برنامه ريزي شده است به طور اتوماتيك حرارتهاي لازم را براي مراحل سه گانه PCR توليد مي نمايد ضمن اينكه تعداد چرخه هاي مورد نياز نيز براي انجام PCR و ازدياد DNA بطور اتوماتيك در اين دستگاه بوقوع مي پيوندد.
با دو پيشرفت فوق الذكر اكنون ما مي توانيم تمامي اجزاء PCR را كه عبارتند از بافر PCR، دو نوع پرايمر، چهار نوع داُكسي نوكلئوتيد تري فسفات dCTP , dTTP , dATP) و (dGTP، آنزيم Taq پليمراز و DNA الگو (كه با روش هاي مختلف قابل استخراج مي باشد)، با همديگر در لوله هاي پلي پروپيلن مخلوط كرده (شكل 2) و پس از افزودن يك قطره روغن معدني بر سطح مخلوط ها، بدون حضور شخص آزمايش كننده لوله هاي PCR را به مدت چند ساعت در ترمال سايكلر برنامه ريزي شده از قبل قرار داد تا PCR انجام شود. واكنش هاي تكميل شده بر روي ژل آگارز برده شده و سپس محصولات PCR يا به عبارت ديگر DNAهاي ازدياد يافته در روي ترانسيلوميناتور ماوراء بنفش 302 نانومتر قابل رويت مي شوند.



شکل 2

[هیوا]

تصویری از دستگاه PCR



انواع PCR :

بمنظور نتيجه گيري بهتر، غير از PCR معمولي روش هاي جديدي از PCR ارائه شده است كه به صورت اجمالي به برخي از آنها اشاره مي شود.



1- آر تي _ پي سي آر (RT-PCR)
(Reverse Transcriptase-PCR)
الگوي اوليه در RT-PCR، مولكول RNA تك زنجيره اي است. از آنجائيكه DNA پليمراز قادر به استفاده از RNA بعنوان الگو نمي باشد، مرحله ديگري به PCR اضافه شده است. طي اين مرحله، با استفاده از آنزيم رورس ترانس كريپتاز (Reverse Transcriptase) RT ، از الگوي RNA، مكمل آن DNA‌C (complementary DNA)
سنتز مي شود و بوسيله تكنيك PCR تكثير مي يابد. بمنظور تعيين گونه و حساسيت دارويي در ويروس شناسي و مايكوباكتريولوژي، از اين روش براي تكثير RNA ريبوزومي استفاده مي شود.



2- نستد – پي سي آر (Nested-PCR)
در اين روش بمنظور افزايش حساسيت PCR از دو جفت پرايمر استفاده مي شود. ابتدا با يك جفت پرايمر اول در طول 30-15 چرخه، قطعات مشخصي از DNA هدف تكثير مي يابند. سپس محصول PCR حاصل به لوله ديگري منتقل شده و بعنوان الگو استفاده مي شود و بوسيله جفت پرايمرهاي دوم مرحله دوم PCR انجام مي شود.



3 - مالتيپلكس – پي سي آر
(Multiplex-PCR)
در اين روش از چند جفت پرايمر اختصاصي براي هدف هاي مختلف استفاده مي شود. در ميكروب شناسي باليني، با استفاده از اين روش امكان شناسايي چندين عامل بيماري در يك نمونه بطور همزمان وجود دارد و مي توان عفونت هاي مخلوط را تشخيص داد.



آرمز – پي سي آر (ARMS-PCR)
(Amplification Refractory Mutation System-PCR)
روش آرمز _ پي سي آر (ARMS-PCR) براي تشخيص موتاسيون هاي نقطه اي بكار مي رود و از دو جفت پرايمر استفاده مي شود. در اين روش، واكنش در دو لوله جداگانه انجام مي شود كه يكي از آنها حاوي پرايمرهاي نوع موتاسيون يافته و ديگري حاوي پرايمرهاي نوع معمولي است. چنانچه تكثير در لوله حاوي پرايمر موتاسيون يافته انجام شود، در DNA هدف، موتاسيون اتفاق افتاده است و تكثير در لوله حاوي پرايمر معمولي، نشان دهنده آن است كه موتاسيوني اتفاق نيفتاده است. از اين متد مي توان در تشخيص موتاسيون هاي مولد مقاومت دارويي در باكتري‌ها استفاده كرد.

[hossien]

روش کار با دستگاه را میشه توضیح بدین منظورم اگر از محلول استفاده میشه کجا قرار می گیره و مکانیزم دستگاه چیه ؟

[هیوا]

محلول های مورد استفاده وقتی طبق توضیحات داده شده در بالا در یک میکرو تیوب(یک تیوب خیلی کوچک با طول تقریبا یک سانتی متر و قطر حدود 5 میلی متر) ریخته و با هم مخلوط شد تیوب ها درون دستگاه pcr قرار داده می شوند.وقتی درب دستگاه pcr مطابق شکل زیر باز می شود


در حفره ای که مشاهده می شود 96 حفره کوچک (مصابق شکل زیر)وجو دارد که می توان 96 میکروتیوب را همزمان در دستگاه قرار داد


سپس دمای مراحل مختلف pcr طبق آزمایش مورد نظر تنظیم میشود و سپس start جهت شروع عملیات زده می شود.
برای تنظیم دما چیزی شبیه صفحه کامپیوتر در جلو دستگاه pcr قرار دارد که در واقع یم مانیتور یا صفحه نمایش است و اطلاعات وارد شده توسط فرد آزمایشگر روی آن نمایش داده می شود.
در زیر تصویری از صفحه نمایش یک دستگاه pcr نشان داده شده است.

[hossien]

می دونید حرارتی که برای باز کردن dna ایجاد می کنه از چه منبعی هست؟

[hossien]

منظورم